Изучение токсических эффектов новых комплексных препаратов ртути с α-аминокислотами — «Меркурид» в условиях хронического применения

Введение.

Использование ртутьсодержащих препаратов нетоксического характера при лечении целого ряда заболеваний в настоящее время можно считать утерянной традицией, несмотря на то, что препараты ртути издавна применялись в медицине. Интерес к ним проявлялся на протяжении веков, вплоть до того периода, который характеризует развитие научной медицины. Общепризнанный факт, что малые дозы тяжелых металлов стимулируют жизнедеятельность самых различных клеток (В.И. Скворцов, Курс фармакологии 1948 г.). Нет ничего неожиданного в том, что комплексные соединения ртути могут обладать иммуностимулирующим, противоопухолевым и другими видами действия, относящимися к адаптогенным (т.е. повышающих неспецифическую резистентность организма к различным неблагоприятным факторам). В связи со сказанным, становится логичным поиск новых препаратов, содержащих ртуть связанную с биологически активными составляющими, что делает такие соединения нетоксичными. Созданный препарат Меркурид, представляет композицию, активной частью которого является комплекс ртути с α- аминокислотами. Авторы Меркурида полагают, что ртуть в препарате оказывает не токсический, а биотический эффект. Биотический эффект в отличие от токсикофармакологического, проявляется при воздействии на организм химических веществ в концентрациях не возбуждающих защитные барьеры и оказывающих целый каскад адаптивных реакций, так как ртуть и α- аминокислоты постоянно присутствуют в организме и используются в микродозах.

Для исследований предоставлен:

«Меркурид» — комплекс ртути с цистеином и метионином растворённый в дистиллированной воде.

Целью данного исследования явилось изучения возможных токсических изменений при хроническом введении 10 — кратных терапевтических доз белым крысам линии «Вистар» препаратов «Меркурид». В качестве контроля выбран водный раствор цистеина, который близок к данным препаратам по показателю рН (с учетом перорального введения) и зарегистрированная биологически активная добавка Вин-Вита.

Изменение состояния животных в условиях хронического введения указанных препаратов проводилось на основе изучения поведенческого эффекта. Гистоморфологического исследования паренхиматозных органов (миокард, печень, почки) животных, забитых после окончания эксперимента, а также определения иммунологического показателя: цитолитической активности Т-лимфоцитов (нулевых лимфоцитов или естественных киллеров).

Исследование характеристики поведения крыс в тесте «Открытое поле»

В изучении механизмов действия фармакологических веществ важным является изучение их влияния на характеристики поведения животных. Отсутствие вербального контакта с животными ограничивает диапазон возможных тестов. Однако, несмотря на эти ограничения, ряд неврологических тестов могут дать сведения о функциях всех уровней центральной нервной системы. Наиболее распространенным и информативным тестом в определении влияния лекарственных веществ на эмоциональное состояния и двигательную активность животных является тест «Открытое поле» (Бурет, 1991).

Помещение животного (крысы) в новое окружение ведет к возникновению исследовательского поведения, которому в то же время препятствуют условия, вызывающие страх. Две антагонистические тенденции характеризуются различным временным ходом. По этой причине, несмотря на уменьшение страха, активность животного к концу опыта снижается. Лучшим выражением уменьшения страха у животных является исследование ими внутренних секторов, которое постепенно становится более интенсивным от опыта к опыту. Данный тест является достаточным для первичного скрининга, а также является адекватным для выявления токсичности препарата.

Целью исследования явилось изучения влияния препаратов «Меркурид» на характеристики поведения белых крыс в тесте «открытое поле» в условиях длительного приема (в течение 1 мес.) 10-кратной терапевтической дозы. Опыты поставлены на 30 половозрелых белых крысах линии «Вистар» массой 220-250 г. Животные содержались в условиях вивария, в отдельных пластмассовых клетках по 5 штук. Кормление и уход за животными проводилось в одно и то же время с 12 до 13 часов. В утренние часы крыс подвергали экспериментальным манипуляциям (введение препаратов, исследование характеристики поведения). Предварительно, с интервалом в 3-4 дня, регистрировали исходные характеристики поведения крыс. Причем в день регистрации характер поведения крыс тестировали дважды с интервалом в один час. Затем крыс распределяли на группы. Первой группе животных (15 крыс) ежедневно давали (поили) 0,9 мл препарата «Меркурид». Второй группе (15 крыс) 0,9 мл контрольного препарата. Препараты вводили крысам с помощью шприца, металлический зонд вводили в ротовую полость на корень языка крысы и малыми порциями, исследуемый препарат заглатывался животными. Регистрацию поведения животных проводили как до введения препаратов, так и через час после очередного введения. Регистрировали характеристики поведения животных после первого, четвертого и шестнадцатого применения препаратов. Аппарат для тестирования представляет собой площадку диаметром 1 м, ограниченную прозрачной стенкой высотой 30 см. Площадка разбита на окружности, которые, в свою очередь, поделены на сектора. Расстояние между окружностями и секторами соизмеримо с размерами крыс. При перемещении крысы пересекают линии секторов. Количество пересечений подсчитывали в течение 1 минуты. С помощью лабораторного счетчика СЛ-1 проводили регистрацию следующих характеристик поведения животных: локомоторная активность (количество пересеченных периферических секторов), ориентировочно-исследовательское поведение (вставание на задние лапки), пересечение центральных квадратов (выход в центр), груминг (косметическое ухаживание за своим телом) и эмоциональное состояние животных: дефекация (по количеству буллов) и диурез — по площади лужиц. Оценка влияния препарата на характеристики поведения животного проводили путем сопоставления величин до введения препарата и через час после его введения. Данные представлены в %.

Влияние препарата «Меркурид» на горизонтальную двигательную активность крыс в тесте «Открытое поле»

Крысы помещенные в незнакомую обстановку испытывают страх и неуверенность, положительный результат, когда животные проявляют активность и этот показатель увеличивается, что свидетельствует о стимуляции ориентировочно-исследовательского поведения и снижении дистресса.

При изучении Меркурида, за 100% был принят уровень характеристик поведения крыс, зарегистрированный за 1 час до введения соответствующего препарата. Многократные (6 раз) предварительные исследования исходного состояния характеристик поведения крыс показали, что горизонтальная двигательная активность крыс при повторном испытании через час снижается до величины 56±3% (принятой за 100 %). Введение препарата не изменяло этот показатель. Через час после введения уровень горизонтальной двигательной активности составил 61±5%. Дальнейшее введение Меркурида активизировало горизонтальную двигательную активность. Так, через час после 5-го введения уровень этой активности составил 96±12%, а после 10-го введения препарата-124±17%. Последующее введение Меркурида привело к улучшению качества шерстного покрова крыс, увеличению массы тела.

По оси Х — дни введения препарата.

Исх. — предварительное исследование исходного состояния горизонтальной двигательной активности крыс до введения препарата.

По оси Y — % от показателя горизонтальной двигательной активности, зарегистрированного за час повторного исследования.

Влияние Меркурида на величину ориентировочно — исследовательского

поведения крыс в открытом поле

Параметр ориентировочно — исследовательского поведения крыс в тесте «открытое поле» характеризуется рядом величин. Этот вид поведения раскрывают: выход в центр, вертикальные стойки и норковый рефлекс.

Выход в центр.

По методике «открытое поле» одной из характеристик ориентировочно — исследовательского поведения крыс является выход в центр, который определяют по количеству пересеченных центральных секторов площади. Попав в незнакомую обстановку, животное испытывает страх: при этом оно старается находиться и передвигаться вдоль стенки или сидит на периферии площадки. После оценки безопасности обстановки крыса может выйти к центральным секторам.

Предварительные исследования исходного состояния крыс показали, что величина выхода в центр крыс в тесте открытое поле через час составляет 48±3% от исходной величины выхода в центр, принятой за 100%. Первое введение препарата Меркурид практически не изменило величины характеристики поведения. Через час после первого введения препарата выход в центр снизился на 43% и составил 57±9 % величины этого показателя до введения. Дальнейшее введение препарата усилило ориентировочно — исследовательское поведение крыс. Это привело к росту выхода животных в центральные квадраты. Так, после 5-го введения препарата величина выхода в центр выросла на 22% и составила 122±14% от величины до введения Меркурида, а после 10-го введения — 114±12%.

Таким образом, хроническое введение Меркурида достоверно усиливает активность крыс по данному показателю.

Вертикальные стойки

Анализ ориентировочно — исследовательского поведения крыс в тесте «открытое поле» по показателю «вертикальные стойки» раскрывает мотивационную составляющую характеристики животных. При этом они пытаются войти в непрямой контакт с предметами, расположенными на расстоянии: крысы принюхиваются к предметам, расположенным за пределами открытого поля. Величина показателя «вертикальные стойки» у всей группы крыс, принявших участие в эксперименте, через 1 час составила 45±2% от исходной величины, взятой за 100%. После 1-го введения препарата, через 1 час, величина вертикальных стоек составила 52±4% от величины, измеренной до введения препарата. После 5-го введения величина вертикальных стоек составила 61±7%, а после 10-го, 95±8%. Как видно из рис.3, хроническое введение препарата сопровождается ростом показателя «вертикальные стойки» у крыс.

Норковый рефлекс

Разновидностью ориентировочно — исследовательского поведения крыс (ОИП), является показатель норкового рефлекса крыс, который свидетельствует о способности животного исследовать открытое поле, в частности, заглядывать в норки. Предварительные испытания показали высокий уровень ориентировочно — исследовательского поведения по показателю «норковый рефлекс» У животных при повторном исследовании через 1 час он снижался и составлял 88±3% от первоначальной величины. Первое введение Меркурида не изменило уровень норкового рефлекса. После 5-го введения препарата уровень норкового рефлекса значительно вырос и составил 220±18%, а после 10-го введения — 250±21 %. Таким образом, Меркурид при хроническом введении вызывал усиление ориентировочно — исследовательского поведения. Это выразилось в увеличении горизонтальной двигательной активности крыс, увеличении показателя «выход в центр», количества вертикальных стоек и в росте норкового рефлекса.

Косметическое поведение крыс

Груминг (косметическое поведение) крыс является важной характеристикой поведения животных в открытом поле. Более того, крысы большую часть времени уделяют вычесыванию своего тела, по сравнению с перемещением в пространстве. По мнению специалистов, исследовавших спектр поведения крыс, груминг тесно коррелирует с двигательной активностью. Поэтому при исследовании лекарственных препаратов эта характеристика поведения особенно ценна. Предварительные испытания показали, что косметические движения (груминг) у крыс через час после первоначального измерения составляет 53±3%, а время косметического поведения — 85±3% от первоначальной величины. Применение Меркурида вызывало увеличение количественного показателя косметического поведения (груминга), но время косметического поведения снижалось. Так, через 1 час после 1-го введения препарата груминг составил 49±4%, после 5-го-85±12%, а после 10-го — 88±14%. Время косметического поведения при этом составляло 76%, 71% и 56% соответственно.

Дефекация

Уровень эмоционального состояния крыс оценивается по количеству дефекаций. Так на рис.7 представлены результаты экспериментального исследования влияния курсового введения Меркурида на эмоциональное состояние крыс. По предварительным исследованиям, уровень дефекации за время тестирования в открытом поле, при повторном измерении через 1 час снижается до 41±3% от первоначальной величины, взятой за 100%. Первое введение препарата практически не изменило уровень дефекации животных. Через 1 час этот показатель составил 57±5% от уровня дефекации до введения препарата. Дальнейшее введение препарата привело к постепенному снижению этого показателя. Так, после 5-го введения, уровень дефекации составил 48±5%, а после 10-го -33±3%. Как видно из данного рисунка курсовое введение Меркурида снижает уровень эмоционального состояния животных (испуг, тревогу, неуверенность). Об этом свидетельствует и уровень диуреза.

Диурез у крыс

Предварительные исследования диуреза показали, что при повторном измерении через 1 час показатель диуреза увеличивается и составляет 200±37% от первоначального уровня диуреза, взятого за 100%. Через 1 час после 1-го введения препарата уровень диуреза снижался и составлял 130±25% (р >0,05). Через час после 5-го введения уровень диуреза увеличивался и составлял 370±50% (р<0,05), а после 10-го введения Меркурида — 260±42% (р>0,05).

Таким образом, препарат Меркурид вызывает повышение ориентировочно — исследовательского поведения крыс, что сопровождается достоверным повышением показателя поведения «выход в центр», активацией горизонтальной двигательной активностью, норкового рефлекса и снижением эмоционального состояния животных.

Иммунологическое исследование

Определение функционального состояния клеточного звена иммунной системы проводилось по показателю цитолитической активности Т-лимфоцитов (нулевых, естественных киллеров). На рис.9, представлены изменения цитотоксической активности Т-лимфоцитов у крыс, получавших Меркурид. Определение цитотоксической активности проведено до начала введения и после 10-го введения препаратов. Как видно из диаграмм, хронический прием препаратов не только не снижает один из важнейших показателей клеточного иммунитета, но даже повышает этот показатель. Эти данные особенно интересны тем, что иммуномодулирующей эффект получен от хронического применения 10-кратных терапевтических дозировок, когда большинство препаратов оказывает угнетающее действие на иммунную систему. По приведенному показателю можно судить о высоком терапевтическом потенциале данного препарата в плане иммуномодулирующей активности.

1 — до введения.

2 — Меркурид

З — Меркурид

Влияние препарата сравнения «Вин Вита» на характеристики поведения крыс в «открытом поле»

Горизонтальная двигательная активность

Как и предыдущие препараты, «Вин Вита» вводили крысам через рот. Следует отметить, что крысы охотно принимали препарат, добровольно сами полностью выпивали свою дозу. На рис. 10, приведены данные по влиянию препарата «Вин Вита» на горизонтальную двигательную активность крыс. Как видно из рисунка, хроническое введение крысам препарата не изменяло уровень подвижности крыс. Все данные, полученные после введения препарата, не отличаются от результатов предварительных исследований. Горизонтальная двигательная активность колебалась от 48±2,9% — после первого введения, 61±5% — после 5-го введения и 56±6% — после 10-го введения препарата.

Вертикальные стойки

На рис. 11 приведены данные по влиянию препарата «Вин Вита» на характеристику поведения крыс «вертикальные стойки». Как видно, хроническое введение препарата не изменяло показатель «вертикальные стойки». Небольшое повышение показателя не является достоверным, и не отличается от данного показателя, полученного в предварительных исследованиях.

Выход в центр

Если хроническое введение «Вин Вита» не изменило таких показателей, как горизонтальная двигательная активность и вертикальные стойки, то показатель «выход в центр» при введении препарата заметно снижался. Так, через час после первого введения «Вин Вита» уровень показателя «выход в центр» не отличался от исходного состояния животных. Через 1 час после 5-го введения препарата уровень выхода в центр составил 36±4%, а после 10-го -25±3%. Достоверное снижение показателя выход в центр под действием «Вин Вита» свидетельствует об уменьшении мотивационной характеристики ориентировочно — исследовательского поведения животных.

Норковый рефлекс

На рис.13, приведены данные по влиянию «Вин Вита» на уровень норкового рефлекса, как видно хроническое введение практически не изменило уровень норкового рефлекса. Таким образом, при хроническом введении «Вин Вита» из всех характеристик ориентированно — исследовательского поведения достоверно снижается только показатель выход в центр.

Косметическое поведение

На рис.14 приведены данные по влиянию хронического введения препарата «Вин Вита» на косметическое поведение крыс. Как видно из рисунка, препарат способствует росту груминга, причем параллельно увеличивается длительность каждого акта (рис.15). Наибольший рост косметического поведения наблюдали после 5-го введения препарата, где уровень косметического поведения составил 95±16%, а время косметического поведения 113±9% от уровня зафиксированного у этих же животных до введения препарата. Через час после 10-го введения препарата уровень косметического поведения остался таким же — 92±16% и 118+10%. Таким образом, хроническое введение препарата «Вин Вита» приводило к достоверному росту показателя косметического поведения животных, но вместе с тем, не сопровождалось изменением шерстного покрова животных, покраснениями кожи или дерматитами.

Дефекация

На рис.16 приведены данные по влиянию препарата «Вин Вита» на уровень дефекации у крыс в «открытом поле». Как видно хроническое введение крысам «Вин Вита» вызвал значительный рост уровня дефекации. Так, через 1 час после 5-го введения препарата уровень дефекации составил 95±8% от уровня, зафиксированного до введения препарата. Через 1 час после 10-го введения этот показатель составил 88±8%. Таким образом_, достоверный рост уровня дефекации под влиянием препарата «Вин Вита» указывает на активацию под его воздействием парасимпатического звена нервной системы.

Диурез

На рис.17 приведены данные по влиянию хронического введения препарата «Вин Вита» на уровень диуреза у крыс в «открытом поле». Как видно, препарат значительно усиливает этот показатель. Так, через 1 час после 5-го введения препарата уровень диуреза составил 1000±112%, a через час после 10-го введения — 794±83% от уровня, определенного до введения препарата.

Гистоморфологические исследования органов

Для исследования были взяты паренхиматозные органы: печень, почка, миокард. В каждом случае бралось по 2 объекта. Исследования проводились на серийных срезах. Материал фиксировался в нейтральном 10% формалине с последующей стандартной проводкой и заливкой целлоидином. Целлоидиновые срезы окрашивались гематоксилин-эозином. Во всех срезах патологий не обнаружено.

Печень контрольной крысы. На снимке умеренная лимфоцитарная инфильтрация преимущественно в портальных трактах. Незначительный анизохроматоз ядер гепатоцитов. Ув.100 Х.

Печень крысы получавшей «Меркурид В». Умеренное полнокровие в центральных отделах долек. Умеренный анизохроматоз ядер гепатоцитов. Ув.100 Х.

Печень крысы получавшей «Меркурид Ц». На снимке гистологическая структура печени без изменений. Ув.100 Х.

Почка крысы получавшей «Меркурид Ц». Гистологическая структура не изменена. Ув.100 Х.

Почка контрольной крысы. Незначительная лимфоцитарная инфильтрация в интерстиции. Ув.100 Х.

Почка крысы получавшей «Меркурид Ц». Умеренная лимфоцитарная инфильтрация в интерстиции. Ув.100 Х.

Заключение

Проведенное экспериментальное исследование позволяет сделать следующие обобщения.

1. Препарат «Меркурид» при хроническом применении в 10-кратной терапевтической дозе не вызывает каких-либо токсических изменений в организме крыс. Препарат хорошо переносится (животные охотно, добровольно его пили), улучшает мотивационные характеристики поведения, внешний вид крыс, достоверно повышает ориентировочно — исследовательского поведения крыс. Снижает уровень тревоги, страха, неуверенности, что в целом можно охарактеризовать как адаптационно-стимулирующее влияние.
2. Необходимо также отметить, что в течение всего времени проведения эксперимента в группе, получавшей «Меркурид» гибели животных не было. В группе животных, получавших контрольный препарат (сухое вино) погибло 2 крысы (причиной смерти, по данным вскрытия, явилась гнойная бронхопневмония). Надо заметить, что за данный период из 30 крыс, находившихся в виварии и незадействованных в эксперименте, погибло 6 животных, что также подтверждает тезис о нетоксичности препаратов «Меркурид» при их хроническом применении в 10-кратной терапевтической дозе, а также противовоспалительном и общестимулирующем эффекте на организм.
3. Для гистоморфологического исследования были взяты паренхиматозные органы: печень, почка, миокард. В каждом случае бралось по 2 объекта. Исследования проводились на серийных срезах. Материал фиксировался в нейтральном 10% формалине с последующей стандартной проводкой и заливкой целлоидином. Целлоидиновые срезы окрашивались гематоксилин-эозином. Во всех срезах патологий не обнаружено.
4. Таким образом, экспериментальные исследования подтвердили отсутствие токсичности «Меркурида». Причем «Меркурид» не только не проявил каких-либо патогенных эффектов, но при хроническом введении в 10-кратной терапевтической дозировке, оказал положительное влияние на Т-клеточное звено иммунной системы в виде увеличения числа цитотоксичных Т-лимфоцитов.
5. Надо отметить более сильное положительное влияние «Меркурида» на мотивационные характеристики крыс в тесте «открытое поле» по сравнению с контрольным препаратом «Вин Вита».

В таких же дозировках, препарат «Вин Вита», вызывает угнетение активности животных и возникновение адаптационного дистресса (увеличения дефекации, мочеиспускания, уменьшение мотивационной характеристики ориентировочно — исследовательского поведения животных).

Установлено, что 10 кратная терапевтическая доза комплексных препаратов ртути в условиях хронического применения не вызывает токсического действия и оказывает адаптогенный и общестимулирующий эффект на организм крыс, что проявляется в активации ориентировочно — исследовательского поведения и мотивационной готовности животных. Увеличении цитолитической активности Т-лимфоцитов.