Отчет об оценке антиоксидантной активности препарата «Меркурид»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ
Отдел патоморфологии и иммунологии Украинского НИИ
глазных болезней и тканевой терапии им. В.П. Филатова

ОТЧЕТ
Оценка антиоксидантной активности препарата «Меркурид»
на начальных этапах свободнорадикального окисления

1. Общие представления о процессах свободнорадикального окисления

Избыточная активация реакций свободнорадикального окисления представляет типичный патологический процесс, встречающийся при самых различных заболеваниях и повреждающих воздействиях на организм. Свободные радикалы — молекулы с неспаренными электронами, находящимися на внешней оболочке атома или молекулы, обладающие очень высокой реакционной способностью и, как следствие, выраженным повреждающим действием на клеточные макромолекулы. Доказано участие свободных радикалов в патогенезе очень многих заболеваний (шок различного генеза; атеросклероз; нарушения мозгового, коронарного и периферического кровообращения; сахарный диабет и диабетическая ангиопатия; ревматоидные, воспалительные и дегенеративные заболевания опорно-двигательной системы; поражения глаз; легочные заболевания; онкологическая патология; термические поражения; различные интоксикации; реперфузионные поражения) и преждевременного старения. Кроме того, к повышенному образованию свободных радикалов в организме приводят прием препаратов с прооксидантными свойствами, проведение ряда лечебных процедур (кислородотерапия, гипербарическая оксигенация, ультрафиолетовое облучение, лазерная коррекция зрения, лучевая терапия), а также различные экологически неблагоприятные факторы окружающей среды.

Механизм свободнорадикального окисления и связанная с ним антиоксидантная система рассматриваются как важнейшее патогенетические звено многих патологических процессов. От этого механизма в значительной степени зависит структурно-функциональная целостность клеток и тканей организма, что напрямую сопряжено с воспалительными процессами, а также старением и опухолевой трансформацией.

Свободнорадикальное окисление обусловлено активными формами кислорода, образующимися в результате ферментативной деятельности оксиредуктазы. При этом образуются ионы кислорода и перекись водорода.

Определенную роль в этом процессе играет аутоокисление катехоламинов. Механизм повреждающего действия реализуется через взаимодействие ионов кислорода и перекиси водорода с образованием гидроксильных радикалов и свободного кислорода. Это приводит в инактивации различных белков, деструктивным изменениям полисахаридов и стимуляции мутагенеза за счет повреждения ДНК.

Активные формы кислорода инициируют перекисное окисление жирных кислот и их дериватов, что приводит к образованию карбонильных соединений, связывающихся с нуклеиновыми кислотами и белками.

Как видно, антиоксидантная защита может стать важным фактором на пути мутагенных изменений, ведущих к образованию неопластических клеток и опухолевой прогрессии.

С целью воздействия на свободнорадикальное окисление в последнее время стали применять антиоксиданты в лечении ишемических заболеваний различной локализации. Широкое применение нашли такие вещества с антиоксидантной активностью, как α-токоферол, дибутинол, оксипиридины.

Однако многие известные антиоксиданты имеют серьезные недостатки: они действуют лишь на конечном этапе свободнорадикального окисления, а при разложении свободных радикалов полиненасыщенных жирных кислот образуют токсичные продукты (см. табл.1).

В связи со сказанным, поиск более эффективных антиоксидантов является актуальной проблемой.

2. Применение хелатных соединений металлов в медицине

Применение соединений металлов в медицине имеет длительный опыт. Металлы считают главными факторами металлообразования и функционирования активных центров большинства ферментов [8, 9]. Для каждого биометалла по диаграмме Бертрана [6] (зависимость «доза элемента — физиологическое действие») существует диапазон оптимальных концентраций in vivo, выход за пределы которых обусловливает нарушение ферментного статуса организма (дефицит элемента) или токсическое влияние (превышение депообразующей потребности в элементе). Поэтому путем к повышению биодоступности и безопасности металлосодержащих препаратов может быть замена ионных соединений микроэлементов их комплексами с органическими лигандами [4, 7]. Подтверждение этого нашло свое отображение в работе Института фармакологии и токсикологии АМН Украины «Комплексообразование как способ повышения безопасности соединений микроэлементов» (Григорьева Г.С., Киричок Л.М., Конахович Н.Ф., Мисливець С.О., Мохорт Н.А.). Рациональность такого подхода была реализована и при создании препарата «Меркурид».

Общеизвестно, что максимальную токсичность проявляют наиболее химически активные частицы, координационноненасыщенные ионы, к числу которых следует отнести ионы свободных металлов. Снижение электрофильных свойств иона соответственно приводит к снижению его токсического действия на организм. Хелатирование свободных ионов металла полидентатными лигандами превращает их в устойчивые, координационно насыщенные частицы не способные разрушить биокомплексы, а, следовательно, малотоксичные. Они мембранопроницаемы, способны к транспортировке и выведению из организма.

3. Научно-экспетиментальные  исследования антиоксидантной активности препарата «Меркурид»

 Объектом исследования явился препарат «Меркурид» — хелатный комплекс ртути с α-аминокислотами — цистеином или метионином. При приеме «Меркурида» микродозы ртути находятся в связанном состоянии с аминокислотами (хелатный комплекс) и в концентрации безвредной для организма, оказывают биотическое воздействие на ряд жизненно важных процессов. Для подтверждения этого тезиса были проведены исследования острой и хронической токсичности «Меркурида».

Острая токсичность изучалась на базе Национального фармацевтического университета (Харьков). Базовый препарат «Меркурид» (сток), в соответствии с классификацией веществ по токсичности, отнесен к 4 классу токсичности (малотоксические вещества, 501<«D₅₀<5000 мг/кг).

Изучение хронической токсичности было проведено отделом патоморфологии и иммунологии Украинского НИИ глазных болезней и тканевой терапии им. В.П. Филатова. Отчет об изучении хронической токсичности  позволяет сделать следующие обобщения.

Сток «Меркурида» при применении в 10-кратной терапевтической дозе на протяжении 2 мес не вызывает токсических изменений в организме крыс. При гистоморфологическом исследовании патологии не выявлено.

Одним из механизмов такого действия, как показали наши предыдущие исследования, является влияние на тиолдисульфидные связи протеинов. Происходящее при этом изменение белкового редокс-потенциала сопровождается конформационными изменениями белков и, в частности, связанных с процессами иммуногенеза и онкогенеза.

Итогом этих изменений, как показали наблюдения, является повышение цитостатической активности клеток иммунной системы и активация апоптоза опухолевых клеток.

Отмеченные свойства «Меркурида», как мы полагаем, в значительной степени связаны с имеющейся в комплексном соединении ртутью. Участие только аминокислотных компонентов «Меркурида» в конформационном воздействии на белки, конечно, маловероятно. В то же время как самостоятельно, так и в хелатном комплексе, цистеин и метионин могут выступать как компоненты антиоксидантной системы. Ранее проведенные исследования «Меркурида» показали наличие у него противовоспалительных, противоопухолевых, противовирусных и иммуномодулирующих свойств (патент Украины №55308А).

Представляет интерес оценка антиоксидантной активности «Меркурида», учитывая, что свободнорадикальное окисление играет важную роль в онкогенезе. Надо также отметить, что изучение свободнорадикальных повреждений и разработка антиоксидантной защиты в процессе химиотерапевтического лечения онкологических больных уже привлекло внимание онкологов. Мы полагаем, что роль антиоксидантов не менее важна также для профилактики ранних и поздних рецидивов, т.е. как лекарственных средств сопровождения адъювантной и неадъювантной терапии.

В данной работе нами использован усовершенствованный метод оценки антиокислительной активности антиоксидантов на начальных этапах свободнорадикального окисления по ингибированию супероксидрадикала в реакции аутоокисления адреналина в адренохром в щелочной среде (рис.1).

Адреналин
Адренохром

Рис.1. Схема аутоокисления адреналина в адренохром

Материалы и методы

В кювету 10 мл спектрофотометра СФ-26 вносили 2,0 мл 0,15 М натрий-карбонатного буфера с добавлением 3·10^-4 мл ЭДТА (рН=10,2), затем прибавляли растворы исследуемых препаратов. Реакцию начинали прибавлением 0,4 мл 2,25·10^-3 М водного раствора адреналина. Исходный кристаллический адреналин растворяли в дистиллированной воде и доводили разбавленной хлороводородной кислотой до рН=2,25. Сначала определяли показатель экстинкции (Е₁), отражающий скорость ингибирования аутоокисления адреналина, а затем показатель экстинкции (Е₂), отражающий скорость аутоокисления адреналина в присутствии исследуемых препаратов. Реакцию проводили при  Т=35-36°С в спектрофотометре СФ-26 при длине волны λ-480 нм, время экстинкции — 3 мин. Антиокислительную активность исследуемых препаратов выражали в % ингибирования аутоокисления адреналина и вычисляли по формуле:

Е₁ — Е₂ х 100
——————————
Е₁

Статистическую обработку проводили с использованием tкритерия Стьюдента.

Различие достоверно по сравнению с контролем Р≤0,001.

Результаты и обсуждение

В данной работе для оценки антиоксидантной активности по ингибированию супероксидрадикала в реакции аутоокисления адреналина в аденохром нами использованы базовые хелатные соединения ртути с аминокислотами (стоки), которые служат в дальнейшем для приготовления по фармакопеи Швабе гомеопатических препаратов:

1. Комплекс ртути с цистеином, обозначен Меркурид Ц (сток);

2. Комплекс ртути с метионином, обозначен Меркурид М (сток);

3. Этилендиаспарагинат Hg(II), (хим. формула C₁₀H₁₀O₈N₂Hg) обозначен Меркурид Ас — новое соединение, полученное авторами, находящееся в стадии исследования и патентования;

4. Гомеопатический препарат, получен от стока Меркурид Ц в разведении С6, обозначен Меркурид Ц, С6 (гомеопатический);

5. Гомеопатический препарат, получен от стока Меркурид М в разведении С6, обозначен Меркурид М, С6 (гомеопатический);

В качестве препаратов сравнения использованы широко известные препараты антиоксидантного действия α-токоферол и диметилсульфоксид, являющиеся одними из наиболее сильных реактиваторов супероксиддисмутазы. Хотя эти препараты получили достаточно широкое распространение в медицинской практике, они обладают побочными эффектами, поэтому поиск новых лекарств лишенных таких свойств остается актуальной задачей.

Таблица 1

Таблица 2. Сравнительная характеристика антиокислительной активности
стоков Меркурида и гомеопатических лекарств на его основе
Меркурида Ц и М в разведении С6

Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Различие достоверно по сравнению с контролем Р≤0,001.

Анализ представленных данных позволяет говорить о наличии антиоксидантной активности у всех исследовавшихся препаратов группы Меркурид. Причем эта активность выше, чем у известного антиоксиданта α-токоферола (гомеопатический препарат Меркурид С6 более чем в три раза превышает антиоксидантную активность α-токоферола).

Вторая серия  проведена через 7 дней после 1 серии с  использованием адреналина, приготовленного ранее. Этим могут быть объяснены более высокие цифры антиоксидантной активности.

Важно отметить, что гомеопатические разведения (Меркурид С6) показали более высокую антиоксидантную активность по сравнению с аллопатическими аналогами (стоками). Возможно, это обусловлено тем, что при высоких разведениях происходит запоминание химических связей,    аминокислоты освобождаются от координационного влияния атома ртути и проявляют действие, связанное с наличием атома серы в своем составе.

Более высокая антиоксидантная активность гомеопатических разведений может быть объяснена и с других позиций. Так, некоторые антиоксиданты при определенных условиях могут, наоборот, провоцировать свободнорадикальное окисление. В частности, это известно для α-токоферола. Этот препарат проявляет антиоксидантную активность в более низких концентрациях, а высоких —  теряет ее.

Надо особо отметить, наличие антиоксидантной активности у хелатного комплекса ртути с аспарагином указывает, что  данный эффект нельзя объяснить только присутствием аминокислоты. В отличие от цистеина и метионина, аспарагин не относится к числу аминокислот с антиоксидантной активностью. Тем не менее,  такая активность есть  у впервые полученного хелатного комплекса аспарагина с ртутью.

ВЫВОДЫ

Таким образом, исследования препаратов группы Меркурид можно рассматривать как лекарственные вещества с очевидной антиоксидантной активностью неферментного характера.

Учитывая различия в уровнях антиоксидантной активности и влияния на тиолдисульфидные белковые связи, «Меркурид»,  рационально назначать при воспалительных заболеваниях или в комплексном лечении онкологического процесса (профилактика рецидивов и последствий лучевой терапии, химиотерапии).

Так, аллопатические формы хелатных соединений ртути проявляют, как было установлено ранее, более сильное воздействие на редокс-потенциал белков, в частности белков, связанных с онкопроцессом. Через влияние на тиолдисульфидные связи  может проявляться иммуногенный и апоптический механизмы воздействия на опухолевый процесс.

Свободнорадикальное окисление, инициирующее перекисное окисление липидов, рассматривается как важнейшее звено  альтерации, запускающей хронические воспалительные процессы,  а также дегенеративно-дистрофические процессы, сопряженные со старением.

В этой связи, целесообразно рассмотреть   перспективы  клинического применения гомеопатических форм хелатных соединений ртути у больных с хроническими воспалительными процессами для коррекции последствий окислительного стресса и синдромов преждевременного старения.

Учитывая антиоксидантную активность и физиологическое влияние на тиолдисульфидные белковые связи, аллопатические и гомеопатические формы Меркурида следует рассматривать перспективными для лечения воспалительных заболеваний, профилактики осложнений после химиотерапевтического лечения, дезинтоксикации, уменьшения повреждения ДНК, вызванных окислительным стрессом, атеросклероза, ишемических заболеваний различной локализации, профилактики старения и развития опухолевых заболеваний.

Литература:

1. Бойцова Л.В. Изменение антиоксидатной системы глутатиона как показатель цитотоксического действия платидиама //
2. Дунаев В.В., Беленичев И.Ф., Ковеленко С.И. и др. Антиорадикальная и антиокислительная активность производных 1,2,4-триазола и хиназола при ишемии головного мозга // Украинский биохимический журнал. — 1996. — Т.68 (№1). — С.100-103.
3. Зайцев В.Г., Закревский В.И. Защита клеток от экзогенных и эндогенных активных форм кислорода: Методические подходы к изучению // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Труды научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии Санкт-Петербургского медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. — С.-Пб., 15-17 октября 1998 года, С.-Пб., 1998. — Т.2. — С.401-405.
4. Координационные соединения металлов в медицине / Е.Е. Крисс, И.И. Волченскова, А.С. Григорьева, К.Б. Яцимирский, Л.И. Бударин. — Киев: Наукова думка, 1986.
5. Коровина Н.А., Захарова И.Н., Обыночная Е.Г. применение антиоксидантов в педиатрической практике // Consilium medicum. — 2003. — Т.5 (№9).
6. Попова И.Ю., Лазарева Д.Н., Зарудный Ф.С. // Экспериментальная клиническая фармакология. — 1996. — Т.59 (№3). — С.72-77.
7. Kemp J.D. // Journal Clinical Immune. — 1999. — V.13 (№2). — P.81-89.
8. Metal ions in biological systems: In 23 vols / Ed. H.Sigel. — N.-Y.; Basel: Dekker, 1975-1994.
9. Trace elements in human and animal nutrition. — 5^th ed. / Ed. W.Mertz. — San Diego, California: Academic Press, 1987.